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液相色譜分析方法開發,你學會了嗎?

日期:2022-04-19 06:42
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摘要: 高效液相色譜分析:是一種高效,快速,準確的分離分析方法,廣泛應用于石油化工、生命科學、環境、醫藥及食品安全行業。分析方法的開發與驗證在不同行業有不同的要求,化學醫療行業對于質量的控制要求非常嚴格,高效液相色譜分析方法是質量控制的重要手段,其開發與驗證對于其它行業來說也有很好的借鑒意義。 液相色譜主要有親水色譜、正相色譜、反相色譜、離子交換色譜、凝膠滲透色譜/體積排阻色譜等幾種色譜分離模式。其中反相色譜是到目前為止*通用的 HPLC 方法,大約占所有方法的 60%,將近 95% 的色譜工作者都在...

高效液相色譜分析:是一種高效,快速,準確的分離分析方法,廣泛應用于石油化工、生命科學、環境、醫藥及食品安全行業。分析方法的開發與驗證在不同行業有不同的要求,化學醫療行業對于質量的控制要求非常嚴格,高效液相色譜分析方法是質量控制的重要手段,其開發與驗證對于其它行業來說也有很好的借鑒意義。


液相色譜主要有親水色譜、正相色譜、反相色譜、離子交換色譜、凝膠滲透色譜/體積排阻色譜等幾種色譜分離模式。其中反相色譜是到目前為止*通用的 HPLC 方法,大約占所有方法的 60%,將近 95% 的色譜工作者都在使用。那么本文我們主要來講反相色譜分析方法的開發。


反相色譜的原理:分析物與疏水固定相之間發生非極性、非特異性相互作用,即分析物在極性流動相和非極性固定相之間分配,與正相色譜相反。反相色譜柱通常使用的固定相有C18、C8苯基。反相色譜系統通常使用的流動相有:a. 水,可含緩沖液,或用酸或堿調節pH , b . 可與水混溶的有機溶劑。


如何來開發一個合理可行的反相色譜分析方法,這其實是每一個色譜工作者必須面對并解決的問題。分析方法的開發其實主要是選擇合適的色譜柱、流動相、檢測波長來得到一個初步分析方法,后面再做其他方面的優化,使色譜峰之間的分離度、峰形、峰高、峰寬滿足要求。下面我們就來仔細講講反相色譜分析方法的開發。


一、色譜柱的選擇

高效液相色譜分析中,色譜柱的選擇直接影響了分離效果的好壞,選擇合適的色譜柱可以縮短方法開發所需的時間,并且使方法更具穩定性。但是我們要清楚現在商品化的液相色譜柱比比皆是,根據色譜柱的參數可以給我們提供一個初步的選擇,但由于各個儀器廠商的填料技術和鍵合技術都有差異。即使都是C18柱,不同品牌、同一品牌不同系列都有不同的功能,有能耐受低pH值的、有耐高溫的、有適合堿性樣品的等等。那就要求我們要對各種類型的色譜柱做充分的了解之后,才能做出合適的選擇。下面我們來講講如何選擇色譜柱吧!

01
填料孔徑的選擇

選擇色譜柱時我們首先要考慮的就是選擇填料的孔徑大小,這怎么來選擇呢,那么我們就要對自己所分析的物質做充分的了解,首先要知道的就是被分析物的分子量,對于分子量<2000的小分子物質我們選擇孔徑80 - 120 孔徑的填料, 而對于分子量 >2000多肽和蛋白質類物質則需要300 孔徑的填料對其進行等度或梯度分離。選擇到合適孔徑大小的填料之后我們才能夠保證目標分子能進入填料,在空隙中與疏水性固定相發生相互作用。

02
鍵合相的選擇

選擇完填料的粒徑之后,我們就到了選擇鍵合相的環節,這一步呢我們就需要多做實驗多試,大多數色譜工作都是從C18鍵合相開始的,在這里呢,我也建議大家將C18作為開始分析的鍵合相,因為其可以*大限度地保留中等極性到非極性化合物。如果用 C18 鍵合相不能優化分離度,或要分析的是蛋白質,或用常規反相溶劑很難從C18上洗脫的強疏水化合物,這時候可以考慮使用短鏈鍵合相如:C8、C3。

03
填料粒徑的選擇

色譜柱填料的粒徑,影響色譜分離度。粒徑越小,分離越快,柱效越高,但柱壓力越高,柱容易被污染,導致柱壽命降低。常見分析柱通常使用5um填料,復雜的多組分樣品分離一般使用3.5um粒徑,更大內徑的制備色譜柱通常使用更大的粒徑。如果固定相選擇是正確,但是分離度不夠,那么選用更小的粒度的填料是很有用的。3.5um填料填充柱的柱效比相同條件下的5um填料的柱效提高近30%;然而,3.5um的色譜柱的背壓卻是5um的2倍,因此如何選擇填料粒徑需要我們根據實際情況而定。

04
色譜柱的長度選擇

在這里我們要清楚柱越長,分離度越高,但柱壓更高,分離所需時間更長;如果想要得到較高的分離度,在壓力和時間允許的情況下盡量選擇長柱,如250mm。如果想要縮短分析時間并且對分離度的要求不高,建議大家使用短柱,可以節約時間,如50mm。

二、流動相的選擇

一般來說,反相LC 的流動相包括水和作為改性劑的乙腈或甲醇。改性劑還有四氫呋喃(THF)和異丙醇。反相色譜中流動相中水相的pH和離子強度在開發對條件微小變化不敏感的耐用方法中非常重要。對于離子型化合物,典型樣品的保留隨 pH 改變而明顯變化。在這類反相系統中,控制 pH 對于保留和選擇性的穩定非常重要。通常在 pH 2 到 4 條件下,保留時間對pH的微小改變穩定性*高,因此色譜工作者將這一pH范圍作為大多數樣品方法開發的起始pH,包括堿性化合物和一般的弱酸。

為了有較好的重現性,所用的 pH 應高于或低于待分離溶質pKa或pKb上下一個pH單位。如果不清楚分析物的pKa,建議大家測試一種以上流動相 pH 可提供*好結果。大多數反相柱都可以在pH 2-8條件下使用,這樣為分離選擇*佳流動相 pH 提供了較寬的范圍。流動相 pH 對色譜分離的影響有多種方式。根據所分析的化合物,pH可能影響選擇性、峰形和保留。如果是可離子化的化合物,如酸或堿,保留因子和選擇性隨 pH的改變變化非常明顯,如果是非極性較強或中性的化合物,pH 對分離度和保留的影響一般不明顯。

在開發可離子化分析物的分析方法時,我們一定要清楚非離子化形態的分析物比離子化形態的分析物保留更好,所以我們調節流動相的pH值,其目的就是防止可離子化分析物離子化。對于酸性分析物而言,應選擇低 pH 緩沖液流動相,以防止分析物離子化。我們了解了分析物的 pKa,才能夠有效地選 擇流動相 pH。緩沖范圍應在其緩沖液離子 pK 值的 +/-1 pH 單位,使流動相的優化具有一定的靈活性。例如, 醋酸鹽的 pKa 為 4.8,緩沖范圍從 pH 3.8-5.8。甲酸鹽的酸性較大,緩沖范圍為 pH 2.8-4.8。對于堿性化合物而言,在高 pH 條件下才能得到其非離子化形態,但這對色譜柱不利。但許多堿性化合物在 低 pH 條件下的保留就已經足夠了。因此,雖然非離子化形態能得到更高的保留,但這對與所有的堿性化合物并不是實用和必要的。在流動相的選擇這一塊以下幾點相當重要,恕小編冒昧,請大家爛熟于心哦。

03
關 pH 的幾點注意事項
  • 離子抑制形態下的分析物具有更好的保留(例如,低pH下的酸和高pH下的堿) 。

  • 在中性和較高pH下,硅膠上的硅醇基發生離子化,增加了堿性分析物的保留(例如,可能發生離子交換相互作用) 。

  • 在方法開發過程中,可選擇流動相pH對保留和選擇性進行優化。

  • 為延長柱壽命,避免使用極端 pH 值(極高或極低)??梢允褂镁彌_液幫助調節 pH 值。緩沖液可以保持pH不變,提高重現性。

  • 選擇流動相改性劑時,一定要考慮檢測器;與 UV 檢測器匹配良好的改性劑不一定與 MS 檢測器兼容。

02
緩沖液選擇
  • 成功的HPLC分離不必完全抑制離子化,通常在流動相緩沖容量足夠的情況下,90% 的抑制即可。

  • 流動相的緩沖容量與配制的摩爾濃度,以及洗脫液的 pH 與緩沖離子 pK 的接近程度有關 通常在高于或低于緩沖離子 pK 1 個 pH 單位內,可以起到緩沖效果。

  • 色譜操作者也可以選擇非緩沖的流動相進行 pH 調節。這對于酸性分析物而言也是常用的,用單一的酸溶液進行色譜分離,酸的濃度應足以使pH比需要值低得多,以防止化合物離子化。

  • 對于堿性物質的分離,選擇是比較有限的。TEA(三乙胺)不能完全溶于水,而且 pK (11) 很高,氨本身可以完全溶于水,但對大多數色譜柱來說pK值過高。

  • 測定流動相pH時,要在水相與有機改性劑混合之前在水相中進行測定,以確保得到準確而可重復的結果。

  • 選擇緩沖鹽時注意緩沖鹽與檢測的相容性,對于UV檢測器來說,在目標波長下緩沖液應完全透光。緩沖液UV截止波長*好低于220 nm。

03
緩沖液配置過程中的注意事項
  • 流動相會因為實驗室中的混合方式而不同。例如,如果要配制甲醇/水=50/50的混合溶劑,應先量取各自的體積,分別置于潔凈的玻璃容器中,然后再將其混合,因為甲醇和水混合溶劑的總體積大于各自體積之和。如果在同一個容器中混合,混合溶劑的總體積就會不同。

  • 流動相脫氣也很重要。在流路中,溶解在溶劑中的氣體可能逸出,形成氣泡,并有可能干擾泵或檢測器的性能。因此我們在配置好流動相之后一定要對其進行脫氣處理,脫氣處理完之后切記不要再對其進行劇烈振搖。

  • 使用正常工作的 pH 計。按照目標pH值校正pH計。用pH計對pH進行可靠的測量非常重要。

  • 確保試劑盡可能新鮮。

  • 先把固體溶解在非常接近終體積的液體中。調節pH到目標值后,再添加液體使溶液達到目標體積。

  • 緩沖液配制完成后,在 HPLC 系統上使用之前要進行過濾,去除水或鹽中可能存在的顆粒。大多數HPLC應用都使用0.45 m濾膜;UHPLC則使用0.22 m濾膜。

三、波長的選擇

做分析方法開發我們需要二極管陣列檢測器,選擇檢測波長和做色譜峰純度檢查,通過色譜 峰純度檢查來保證主峰里沒有掩蓋其它雜質,做純度檢測對波長選擇的要求比較簡單,原則 是把盡量多的雜質在色譜圖上體現出來。很多雜質只有在低波長下才有紫外吸收,所以我們 選擇盡可能低的波長,乙腈的截止波長在 190~195nm,用乙腈做流動相檢測波長可以選擇 在 210~220nm。也有公司要求分別選取產品紫外吸收*強的波段和 210~220nm 兩個波段做 對比,哪個純度低以哪個為準,這樣可以更嚴格的控制產品的質量。

四、分析方法的優化
01
改變梯度斜率

更緩的梯度斜率可以提高分離度,降低梯度斜率將降低靈敏度, 更陡的梯度斜率可能壓縮色譜峰,經常會導致分離度的降低, 增加梯度斜率將增加靈敏度, 改變梯度斜率時要平衡峰高與分離度的關系。

02
改變柱溫

溫度會影響色譜分析中的每一個化學過程,例如增加溫度會降低移動相的粘度,如果流動速度恒定將導致系統背壓降低,高溫將改變固定相和流動相之間的分配速率,然而由于提高了被測物分散性,會加快優化線性速度。對溫度變化敏感的化合物,溫度的微小變化都會導致選擇性發生獨特變化。在這里我們要注意選擇柱溫一要考慮色譜柱的承受范圍,二要考慮該溫度下,檢測成分是否會降解。





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